CIENCIAS DE LA SALUD - Artículo Cient�fico
DETECCIÓN POR PCR DE STAPHYLOCOCCI ENTEROTOXIGÉNICO DE ALIMENTOS Y MANIPULADORES DE ALIMENTOS
PCR FOR THE IDENTIFICATION OF ENTEROTOXIGENIC STAPHYLOCOCCI FROM FOOD AND FOOD HANDLERS
Maria Consuelo Vanegas López1; Aida Juliana Martínez León2; Mayra Viviana Medrano Medina3
1Microbióloga M.Sc. Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos, Dpto. Ciencias Biológicas, U. de Los Andes. Cra. 1 No 18 a 10 Edificio J209. Correo electrónico:mvanegas@uniandes. edu.co
2Microbióloga. Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos, Dpto Ciencias Biológicas, U. de Los Andes.ai-marti@uniandes.edu.co.
3Microbióloga M.Sc. Laboratorio de Ecología Microbiana de Alimentos, Dpto. de Ciencias Biológicas, U. de Los Andes. m.medrano435@egresados.uniandes.edu.co
Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 10 (2): 145-153, 2007
RESUMEN
La intoxicación por toxinas estafilococcicas es una de las principales enfermedades transmitidas por alimentos, causada por Staphylococcus enterotoxigénicos, debido al manejo inapropiado de los alimentos. El objetivo de este estudio fue el de determinar la frecuencia de cepas enterotoxigénicas de Staphylococci productoras de toxina A, B, C y D aisladas de manipuladores de alimentos y de alimentos utilizando la técnica de PCR. 150 cepas de Staphylococci fueron aisladas de 40 manipuladores y 75 muestras de alimentos. Se identificaron las cepas por microbiología tradicional y se realizó PCR para la detección de los genes sea, seb, sec y sed. El 63,33% (95) de los aislamientos correspondían a S. aureus y el 22% (33) a S. intermedius; el resto de aislamientos (22; 14,67%) no se lograron identificar hasta especie debido a reacciones bioquímicas atípicas. El 22,66% de las 34 cepas (19 alimenticias y 15 humanas) fueron enterotoxigénicas con una mayor frecuencia de cepas productoras de toxina A (10,66%, 13 humanas y tres alimentos), seguido por cepas productoras de toxina C (9,33% tres humanas y once alimenticias) y de toxina B (2,67%, tres humanas y una alimenticia). Un 0,66% de las cepas fueron productoras de toxina A y C (una alimenticia) y no se detectaron cepas productoras de toxina D. Se demostró la presencia de cepas enterotoxigénicas de Staphylococci en manipuladores de alimentos y alimentos con una frecuencia general de 22,66%. Debido a la rapidez de resultados, el PCR se puede utilizar en la caracterización toxigénica de Staphylococci para proteger la salud pública.
Palabras clave: Salud humana, intoxicación alimentaria, Staphylococcus spp., reacción en cadena de la polimerasa, manejo de alimentos.
SUMMARY
Staphylococcal food poisoning is caused by enterotoxigenic Staphylococci due to inappropriate food handling. The objective of this study was to determine the frequency of enterotoxigenic A, B, C and D Staphylococci strains isolated from food handlers and food by Polymerase Chain Reaction (PCR).150 Staphylococci strains were isolated from 40 food handlers and 75 food products. These strains were identified by traditional microbiology and submitted to PCR analysis for the detection of sea, seb, sec and sed genes. 63.33% (95) of the isolates were identified as S. aureus and 22% (33) were identified as S. intermedius; the rest of the isolates (22, 14.67%) were not identified to species due to atypical biochemical reactions. 22.66% of the 34 isolates (19 food and 15 humans) were found to be enterotoxigenic with a greater incidence of toxin A producer strains (10.66%, 13 humans and 3 food), followed by toxin C (9.33%, 3 food, 11 food) and of toxin B (2.67%, 3 humans, 1 food); 0,66% of the strains were A and C producers (1 food); toxin D producer strains were not detected in the 150 strains. The presence of Staphylcococci enterotoxigenic strains in food handlers and food was demonstrated with an overall frequency of 22.66%. Due to the quick results PCR can be used in the toxigenic characterization of Staphylococci to protect public health.
Key words: Human health, food poisoning, Staphylococcus
INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista que causa una gran variedad de infecciones incluyendo abscesos y septicemia (Kúzma et al. 2003a; Normanno et al. 2007). El hábitat principal de S. aureus en humanos es la membrana mucosa de la nasofaringe, donde permanece como miembro de la flora normal sin causar enfermedad (Fueyo et al. 2005; Choudhurry et al. 2006). Diferentes especies de Staphylococcus pueden producir enterótoxinas, tales como S. aureus, S. intermedius, S. epidermidis, S. hyicus y S. warneri (Escartin, 2000; Aragon-Alegro et al. 2007). Algunas de estas especies están involucradas en Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs), donde uno de los principales agentes causales es S. aureus (Aragon-Alegro et al. 2007; Simon & Sanjeev, 2007). Intoxicaciones causadas por S. aureus han sido registradas en diferentes países. En Latino América ha sido reportado como el segundo patógeno más importante causante de ETAs, con una frecuencia del 34,5% durante el periodo de 1993-2001 (Perdomo, 2004). La intoxicación estafilocóccica es una de las enfermedades más importantes económicamente en los Estados Unidos. Las pérdidas económicas en gastos médicos y productividad debido a S. aureus alcanzan US$1,500,000,000 por a�o (Cenci-Goga et al. 2003; Normanno et al. 2007). Generalmente, la enfermedad se caracteriza por la aparición repentina de síntomas, incluyendo náuseas, vómito, dolores abdominales y diarrea dentro de las dos a seis horas siguientes, debidoa la ingestión de toxinas termoestables producidas en el alimento (Fueyo et al. 2005; Holeckova et al. 2002).
S. intermedius está cercanamente relacionado a S. aureus: ambas especies producen coagulasa, termonucleasa y algunas cepas son capaces de producir enterótoxinas. S. intermedius es reconocido como parte de la flora microbiana de la piel, cavidad oral y nasal de perros sanos y otros animales (Hauschild & Wo�Jcik, 2007). Raramente ha sido encontrado en humanos, incluso entre individuos con exposición frecuente a los animales. Sin embargo, S. intermedius es responsable de infecciones asociadas a mordeduras caninas y ha sido implicado en intoxicación alimentaria (Kúzma et al. 2003b; Sandel & McKillip, 2004). Las toxinas estafilocóccicas (SEs, por sus siglas en ingles staphylococcal enterotoxins) son miembros de un subgrupo de proteínas relacionadas con la familia de las toxinas pirogénicas mostrando un número diverso y único de actividades biológicas (Lawrynowicz-Paciorek et al. 2007). SEs son distinguibles de otros miembros de esta familia por sus habilidades eméticas y diarreicas una vez ingeridas (Escartin, 2000) y siendo los responsables de la intoxicación alimentaría por Staphylococcus (SFP, por sus siglas en Inglés staphylococcal food poisoning), con un gran impacto público y sanitario. Hasta el momento, 20 diferentes SEs han sido identificadas: las clásicas SEA, SEB, SEC, SED y SEE y las recientemente descritas SEG, SEH, SEI y SEJ. No todos los Staphylococci son productores de enterótoxinas y la producción de la enfermedad depende de la cantidad de toxina producida (Becker et al. 2001; Loncarevic et al. 2005).
Se han desarrollado pruebas inmunológicas y biológicas para la detección de SEs (Fueyo et al. 2005; Lawrynowicz- Paciorek et al. 2007; Normanno et al. 2007). Para determinar la presencia de SE en un cultivo bacteriano, la aglutinación pasiva inversa por látex (SET-RPLA) ha sido el método de elección; tiene un bajo límite de detección y sólo es posible diferenciar entre cuatro tipos de enterótoxinas clásicas (SEA, SEB, SEC y SED) a partir de un aislamiento bacteriano (Becker et al. 2001; Morandi et al. 2007). Actualmente, se están empleando ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la detección directa de SE en alimentos. Se han venido desarrollando investigaciones utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de cepas enterotoxigénicas, una técnica rápida, específica y sensible (Boerema et al. 2007; Morandi et al. 2007; Tkáciková et al. 2003). El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de cepas de Staphylococci enterotoxigénicas (SEA, SEB, SEC y SED) aisladas de manipuladores de alimentos y alimentos mediante PCR, utilizando los iniciadores específicos. En Colombia existe poca información acerca de la caracterización enterotoxigénica de cepas de Staphylococci circulantes en los alimentos y en manipuladores de alimentos, debido a que no hay métodos disponibles que permitan determinar específicamente el tipo de cepas toxigénicas circulantes. Por lo anteriormente expuesto y debido a la necesidad de determinar la frecuencia real de estas toxinas en nuestro medio, se utilizó la técnica de PCR (Fueyo et al. 2005).
MATERIALES Y MÉTODOS
Como controles, se emplearon las siguientes cepas de referencia: S. aureus no enterotoxigénico cepa ATCC 27692; S. aureus productor de SEC y S. aureus productor de SED (donadas por el doctor Cenci Goga, Universita� Degli Studi Di Perugia, Facoltá di Medicina Veterinaria); S. aureus productor de SEA, productor de SEB y S. epidermidis ATCC 122228 utilizada como control negativo (donadas por la Secretaría Distrital de Salud de Bogotá, Colombia). Las cepas fueron conservadas a -20°C y se recuperaron en Infusión Cerebro Corazón (BHI, Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire, England), 24 horas antes del análisis.
Se realizó un muestreo piloto, en el cual, se aislaron 150 cepas de Staphylococcus spp. a partir de 75 muestras de alimentos y 40 manipuladores de alimentos pertenecientes a siete plantas procesadoras en Bogotá. Las muestras de alimentos, incluyendo queso, leche, jamón y crema de leche, tomadas en un periodo de un a�o (mayo 2004-mayo 2005), se adquirieron en plazas de mercado de Bogotá y se transportaron al laboratorio bajo refrigeración, para ser procesadas en un periodo no mayor a tres horas, de acuerdo al método de la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (US FDA, 1998).
Los frotis de los manipuladores fueron realizados con hisopos estériles de algodón en manos, en garganta y en nariz y fueron transportados al laboratorio en 10ml de solución salina estéril al 0,85%, bajo refrigeración. Las muestras, se procesaron dentro de las dos horas siguientes a la toma de muestra; se sembró por aislamiento en cajas de Agar Salado Manita, Agar Sangre, y Agar Vogel Jhonson y se incubaron durante 24-48h a 37°C (todos los medios fueron adquiridos de Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire, England).
Las cepas de S. aureus y S. intermedius fueron identificadas por microbiología tradicional, de acuerdo a los métodos descritos por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (US FDA, 1998). Las cepas debían ser cocos Gram positivos, telurito positivo, beta hemolíticas, productoras de ADNasa y termonucleasa, colonias blancas ó con pigmento amarillo, de acuerdo al protocolo reportado previamente. Las cepas se confirmaron, adicionalmente, con el kit Crystal BBL kit (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, USA) y el software para Gram positivas versión 4.0 se utilizó para interpretar los resultados.
Para la obtención de ADN, se concentraron las células a partir de 1 ml de un cultivo overnight en Infusión Cerebro Corazón (BHI, Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire, England) y el ADN fue extraído utilizando el estuche comercial de Aislamiento de DNA Procariótico proDNA 2003 (Corporación Corpogen), según las indicaciones del fabricante. Las muestras de ácido nucleico fueron resuspendidas en 50�l de la solución de reconstitución del kit, cuantificadas con el espectrofotómetro Biomate3 (Thermo Spectronic, Rochester, N.Y.), con lecturas a A260/280 nm y ajustadas a una concentración final de 60ng/�l. La pureza del ADN fue determinada con la relación de los valores A260/280 (datos no mostrados). El ADN purificado fue conservado a -20°C.
Para la detección de genes enterotoxigénicos por PCR, se utilizaron primers específicos para detectar los genes sea, seb, sec y sed, previamente reportados (McLauchlin et al. 2000) y sintetizados por Promega (Promega Corporation). Las amplificaciones fueron llevadas a cabo en un volumen final de 25�l conteniendo: 12,5�l de 2X PCR Master Mix (Promega Corporation); 1�M de cada primer; 240ng de ADN templado (3�l); 4,2�l de MgCl2 25mM (Corporación Corpogen) y 0,3�l de Taq polimerasa 5U/�l (TucanTaq, Corporación Corpogen).
Las reacciones, se realizaron en un termociclador Gene- Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, USA, con el siguiente perfil de amplificación: denaturación inicial a 94°C por 4 min, seguido por 30 ciclos de denaturación a 94°C por 2 min, anillaje a 55°C por 2 min y extensión a 72°C por 1 min, con un ciclo final de extensión a 72°C por 7 min (Wang et al. 1997). Se realizaron dos repeticiones para cada cepa y cada gen con el respectivo control positivo y el control negativo (S. epidermidis), para cada amplificación toxigénica.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La intoxicación por toxinas estafilococicas es una de las causas más comunes de ETAs, debido a la habilidad de las cepas de sintetizar una o más enterótoxinas (Normanno et al. 2007). El uso de técnicas moleculares, como PCR, ha sido reportado en varios estudios como una técnica sensible, rápida y específica para la detección de genes enterotoxigénicos producidos por Staphylococci y como una medida de control importante en las industrias procesadoras de alimentos (Tkáciková et al. 2003; McLauchlin et al. 2000; Morandi et al. 2007; Boerema et al. 2007).
Diferentes aislamientos de Staphylococci de alimentos y de manipuladores de alimentos fueron obtenidos en este estudio. Un total de 150 cepas fueron analizadas, de las cuales 95 (63,33%) fueron identificadas como S. aureus, correspondientes a 21 cepas obtenidas de frotis de nariz, siete fueron de garganta, una de manos y 66 cepas de alimentos; 33 cepas (22%) se indentificaron como S. intermedius, correspondientes a 14 cepas de nariz, dos de garganta, 15 de manos y dos de alimentos y, adicionalmente 22 cepas (14,67%) no pudieron ser identificadas hasta especie, debido a pruebas bioquímicas atípicas por el método tradicional y el estuche Crystal de BBL. Estos resultados muestran una gran diversidad de Staphylococci circulantes en alimentos y en manipuladores. Se encontró un número considerable de S. intermedius circulante en humanos (31 cepas) correspondiente al 44,28% del total de los aislamientos humanos (figura 1).
Los resultados de este estudio muestran que la nariz es uno de los hábitat más comunes de S. aureus coincidiendo, de esta forma, con otros autores, quienes reportan que la contaminación de los alimentos en las plantas procesadoras se debe a los manipuladores de alimentos y a portadores asintomáticos con lesiones en la piel (Choudhurry et al. 2006; Morandi et al. 2007; Uemuera et al. 2004). Así mismo, se reporta que S. intermedius fue aislado en un número mayor al esperado de seres humanos; hallazgo importante, ya que este microorganismo ha sido raramente aislado de humanos, puede ser confundido con S. aureus y ha estado implicado en brotes por infección en Estados Unidos (Kúzma et al. 2003a).
En este estudio, se detectaron genes para cuatro tipos de enterótoxinas (SEA, SEB, SEC, SED), con una especificidad y discriminación de 100% entre los mismos. Los productos de PCR obtenidos, se muestran como una banda única de 120 pb para sea, 478 pb para seb, 257 pb para sec y 317 pb para sed sin ningún tipo de amplificación adicional (figura 2). Los resultados muestran que el 22,66% (34 de las 150 cepas analizadas fueron positivas para una o más de las SE evaluadas) de los aislamientos fueron enterotoxigénicos (19 cepas humanas y 15 de alimentos), presentando una mayor frecuencia de cepas productoras de toxina A (10,66%), correspondientes a 13 cepas de manipuladores y tres de alimentos, seguido por cepas productoras de toxina C (9,33%), correspondientes a once cepas de alimentos y once humanas. Se encontró una menor frecuencia de cepas productoras de toxina B (2,67%; tres cepas humanas y una de alimentos) y no se encontró ninguna cepa productora de toxina D. Se detectó una sola cepa productora de toxina A y C (0,66%) aislada de alimentos (tabla 1, tabla 2). Un número significativo de cepas productoras de toxina A fue encontrado en humanos (13 cepas), de las cuales dos pertenecían al género S. intermedius, seguido de toxina C (once cepas). Un menor número de cepas productoras de toxina B fue encontrado en humanos (tres cepas). Estos resultados son importantes, ya que éste es el primer estudio en el cual se reportan cepas productoras de toxinas de S. intermedius y en Colombia sólo se busca S. aureus coagulasa positivo, descartando otro tipo de cepas que pueden ser productoras de toxinas. Según otros autores, la producción de enterótoxinas se ha visto asociada a otras especies, como S. intermedius (Kúzma et al. 2003b; Sandel & McKillip. 2004). Los resultados obtenidos en estudios previos referentes a la expresión toxigénica no llegan a un consenso; McLauchin et al. (2000), indican a SEA como la toxina más común, mientras que Holecková et al. (2002), registran a SEB como la más frecuente en alimentos y Udo et al. (1999), reportaron esta toxina como la más común en hisopados de manos y nariz. En varios estudios SEA y SEB han sido reportadas como las enterótoxinas más comunes causantes de ETAs (Holeckova et al. 2004).
En Colombia, la expresión enterotoxigénica de las cepas circulantes no ha sido estudiada y, en algunas ocasiones, el número de casos de intoxicación ha sido subestimado. Estos resultados contribuirán para determinar la severidad de este problema y el tipo de enterotoxinas estafilococcicas que se encuentran en nuestro medio.
La técnica de PCR descrita anteriormente es una herramienta rápida y sensible para la detección de genes enterotoxigénicos de aislamientos humanos y alimenticios. Este protocolo puede ser empleado en los laboratorios de microbiología de alimentos como un método de rutina, ya que la caracterización enterotoxigénica de las cepas aisladas de este patógeno es importante para la industria de alimentos.
Respecto a la frecuencia de S. aureus es importante mencionar que un alto número de cepas corresponden a muestras de nariz, lo cual se relaciona con la literatura, puesto que se ha reportado que los manipuladores de alimentos portadores de S. aureus en sus fosas nasales son una fuente importante de contaminación de alimentos (Acco et al. 2003).
Este estudio es un acercamiento al problema de Staphylococci enterotoxigénicos en Colombia, así como a la implementación de PCR, como una herramienta de identificación rápida, sensible y específica de genes involucrados en la intoxicación por enterotoxinas, debido a que los kits serológicos no están disponibles en nuestro país y otros métodos disponibles no determinan el tipo específico de SE. Los resultados obtenidos indican que existen cepas enterotoxigénicas de S. aureus y de S. intermedius circulando en los alimentos y manipuladores de alimentos de nuestro medio. Teniendo en cuenta que S. aureus es un microorganismo indicado de las condiciones higiénicas y que su presencia determina que existen deficiencias durante el procesamiento, almacenamiento y manipulación de los alimentos. Se recomienda la técnica de PCR como una herramienta para ser empleada en los laboratorios de microbiología de alimentos, como un método de rutina. Así mismo, se sugiere el reforzamiento de las Buenas Prácticas de Manufactura a través del control de la flora normal de los manipuladores, previniendo por ende la transmisión de Staphylococcus productores de SEs a los alimentos por la manipulación inapropiada de los mismos.
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Recibido: julio 11 de 2007 Aceptado: octubre 22 de 2007
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